Các sản phẩm
Bộ phát hiện Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR cho 2019-nCoV
Mức sử dụng dự kiến
Bộ dụng cụ này được sử dụng để phát hiện định tính vi-rút corona mới (2019-nCoV) bằng cách sử dụng tăm bông ngoáy họng, gạc mũi họng, dịch rửa phế quản phế nang, đờm. Kết quả phát hiện của sản phẩm này chỉ mang tính chất tham khảo lâm sàng và không nên được sử dụng làm phương pháp duy nhất bằng chứng cho chẩn đoán và điều trị lâm sàng. Một phân tích toàn diện về tình trạng được khuyến nghị kết hợp với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân và các xét nghiệm khác trong phòng thí nghiệm.
nguyên tắc kiểm tra
Bộ kit dựa trên công nghệ RT-PCR một bước.Trên thực tế, các gen ORF1ab và N của virus corona mới 2019 (2019-nCoV) đã được chọn làm vùng mục tiêu khuếch đại.Các đoạn mồi cụ thể và đầu dò huỳnh quang (đầu dò gen N được dán nhãn FAM và đầu dò ORF1ab được dán nhãn HEX) được thiết kế để phát hiện RNA của virus corona chủng mới 2019 trong các mẫu.Bộ này cũng bao gồm một hệ thống phát hiện kiểm soát nội sinh (đầu dò gen kiểm soát nội được dán nhãn CY5) để theo dõi quá trình thu thập mẫu, khuếch đại RNA và PCR, do đó giảm kết quả âm tính giả.
Các thành phần chính
| Các thành phần | Âm lượng（48T/Bộ） |
| Dung dịch phản ứng RT-PCR | 96µl |
| hỗn hợp thăm dò TaqMan mồi nCOV（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Kiểm soát tiêu cực | 1500µl |
| nCOV Kiểm soát dương tính（l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Thuốc thử riêng: Thuốc thử chiết xuất hoặc tinh chế RNA.Đối chứng âm tính/dương tính: Đối chứng dương tính là RNA chứa đoạn mục tiêu, trong khi đối chứng âm tính là nước không có axit nucleic.Trong quá trình sử dụng, chúng nên tham gia vào quá trình chiết xuất và nên được coi là có khả năng lây nhiễm.Chúng phải được xử lý và thải bỏ theo các quy định có liên quan.
Gen tham chiếu bên trong là gen RnaseP của con người.
Điều kiện bảo quản và ngày hết hạn
-20±5℃, tránh đóng băng và rã đông nhiều lần hơn 5 lần, có giá trị trong 6 tháng.
dụng cụ áp dụng
Với FAM / HEX / CY5 và thiết bị PCR huỳnh quang đa kênh khác.
Yêu cầu mẫu vật
1. Các loại bệnh phẩm có thể áp dụng: gạc họng, gạc mũi họng, dịch rửa phế quản phế quản, đờm。
2. Lấy mẫu (kỹ thuật vô trùng）
Gạc họng: Lau amiđan và thành sau họng bằng 2 miếng gạc cùng lúc, sau đó nhúng đầu tăm bông vào ống nghiệm chứa dung dịch lấy mẫu
Đờm: Sau khi bệnh nhân ho sâu, lấy đờm đã ho vào ống nghiệm có nắp vặn chứa dung dịch lấy mẫu;dịch rửa phế quản phế nang：Lấy mẫu bởi các chuyên gia y tế.3. Bảo quản và vận chuyển mẫu
Các mẫu bệnh phẩm để phân lập vi rút và xét nghiệm RNA nên được xét nghiệm càng sớm càng tốt.Các mẫu có thể được phát hiện trong vòng 24 giờ có thể được bảo quản ở 4℃;những thứ không thể được phát hiện trong vòng 24
giờ nên được bảo quản ở -70℃hoặc thấp hơn (nếu không có điều kiện bảo quản là -70℃, chúng nên được
được bảo quản tạm thời ở tủ lạnh -20℃).Các mẫu bệnh phẩm nên tránh đông lạnh và rã đông nhiều lần trong quá trình vận chuyển.Mẫu bệnh phẩm nên được gửi đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt sau khi lấy.Nếu các mẫu cần được vận chuyển trên một khoảng cách dài, nên bảo quản đá khô.
Phương pháp thử
1 Xử lý mẫu và tách chiết RNA (khu vực xử lý mẫu)
Nên lấy 200μl mẫu lỏng để chiết RNA.Để biết các bước chiết xuất liên quan, hãy tham khảo hướng dẫn của bộ dụng cụ chiết xuất RNA thương mại.Cả tiêu cực và tiêu cực
điều khiển trong bộ này đã được tham gia vào việc khai thác.
2 Chuẩn bị thuốc thử PCR (khu vực chuẩn bị thuốc thử)
2.1 Lấy tất cả các thành phần ra khỏi bộ, rã đông và trộn ở nhiệt độ phòng.Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong vài giây trước khi sử dụng;tính toán lượng thuốc thử cần thiết và hệ thống phản ứng được chuẩn bị như trong bảng sau:
| Các thành phần | Khẩu phần N (hệ thống 25µl) |
| hỗn hợp thăm dò TaqMan mồi nCOV | 18 µl × N |
| Dung dịch phản ứng RT-PCR | 2 μl × N |
| *N = số mẫu xét nghiệm + 1 (đối chứng âm tính) + 1 (nCOVkiểm soát tích cực) | |
2.2 Sau khi trộn đều các thành phần, tiến hành ly tâm trong thời gian ngắn để toàn bộ chất lỏng trên thành ống chảy xuống đáy ống, sau đó chiết 20 µl hệ thống khuếch đại vào ống PCR.
3 Lấy mẫu (khu vực chuẩn bị mẫu bệnh phẩm)
Thêm 5μl đối chứng âm tính và dương tính sau khi chiết xuất.RNA của mẫu cần kiểm tra được thêm vào ống phản ứng PCR.
Đậy chặt ống và ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong vài giây trước khi chuyển sang khu vực phát hiện khuếch đại.
4 Khuếch đại PCR (khu vực phát hiện được khuếch đại)
4.1 Đặt ống phản ứng vào ô chứa mẫu của thiết bị và cài đặt các thông số như sau:
| sân khấu | Xe đạp con số | Nhiệt độ(°C) | Thời gian | bộ sưu tậpđịa điểm |
| Đảo ngượcphiên mã | 1 | 42 | 10 phút | - |
| tiền biến tínhn | 1 | 95 | 1 phút | - |
| Xe đạp | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | tuổi 30 | thu thập dữ liệu |
Lựa chọn kênh phát hiện thiết bị: Chọn kênh FAM、HEX、CY5 cho tín hiệu huỳnh quang.Để tham khảo NONE huỳnh quang, vui lòng không chọn ROX.
5 Phân tích kết quả (Vui lòng tham khảo hướng dẫn thử nghiệm của từng thiết bị để cài đặt)
Sau phản ứng, lưu kết quả.Sau khi phân tích, điều chỉnh giá trị bắt đầu, giá trị kết thúc và giá trị ngưỡng của đường cơ sở theo hình ảnh (người dùng có thể điều chỉnh theo tình hình thực tế, giá trị bắt đầu có thể được đặt thành 3 ~ 15, giá trị kết thúc có thể được đặt thành 5~20, điều chỉnh) trong biểu đồ logarit Tại ngưỡng của cửa sổ, đường ngưỡng nằm trong pha logarit và đường cong khuếch đại của điều khiển âm là một đường thẳng hoặc bên dưới đường ngưỡng).
6 Kiểm soát chất lượng（Kiểm tra có bao gồm kiểm soát thủ tục） Kiểm soát âm: Không có đường cong khuếch đại rõ ràng cho các kênh phát hiện FAM, HEX, CY5
Kiểm soát dương COV: đường cong khuếch đại rõ ràng của các kênh phát hiện FAM và HEX, giá trị Ct≤32, nhưng không có đường cong khuếch đại của kênh CY5;
Các yêu cầu trên phải được đáp ứng đồng thời trong cùng một thí nghiệm;nếu không, thí nghiệm không hợp lệ và cần phải được lặp lại.
7 Xác định kết quả.
7.1 Nếu không có đường cong khuếch đại hoặc giá trị Ct > 40 ở kênh FAM và HEX của mẫu xét nghiệm, đồng thời có đường cong khuếch đại ở kênh CY5 thì có thể phán đoán rằng không có vi rút corona mới 2019 (2019-nCoV) RNA trong mẫu;
.2 Nếu mẫu xét nghiệm có các đường cong khuếch đại rõ ràng trong các kênh FAM và HEX, đồng thời giá trị Ct ≤40, thì có thể đánh giá rằng mẫu đó dương tính với vi rút corona mới 2019 (2019-nCoV).
7.3 Nếu mẫu thử chỉ có đường cong khuếch đại rõ ràng ở một kênh FAM hoặc HEX và giá trị Ct ≤40 và không có đường cong khuếch đại ở kênh còn lại thì cần kiểm tra lại kết quả.Nếu kết quả xét nghiệm lại phù hợp, mẫu có thể được đánh giá là dương tính với vi khuẩn mới.
vi-rút corona 2019 (2019-nCoV).Nếu kết quả xét nghiệm lại là âm tính, có thể phán đoán rằng mẫu đó âm tính với vi-rút corona mới 2019 (2019-nCoV).
Giá trị phán xét tích cực
Phương pháp đường cong ROC được sử dụng để xác định giá trị CT tham chiếu của bộ và giá trị tham chiếu kiểm soát nội bộ là 40.
Giải thích kết quả xét nghiệm
1. Mỗi thí nghiệm phải được kiểm tra đối chứng âm tính và dương tính.Kết quả xét nghiệm chỉ được xác định khi mẫu chứng đạt yêu cầu về quản lý chất lượng
2.Khi các kênh phát hiện FAM và HEX dương, kết quả từ kênh CY5 (kênh kiểm soát nội bộ) có thể âm do cạnh tranh hệ thống.
3. Khi kết quả kiểm soát nội bộ là âm tính, nếu các kênh phát hiện FAM và HEX của ống nghiệm cũng âm tính, điều đó có nghĩa là hệ thống bị vô hiệu hóa hoặc hoạt động sai, xét nghiệm không hợp lệ.Do đó, các mẫu cần phải được kiểm tra lại.
