Các sản phẩm
Bộ phát hiện Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR cho 2019-nCoV
Mức sử dụng dự kiến
Bộ sản phẩm này được sử dụng để phát hiện định tính virus Corona mới (2019-nCoV) bằng cách sử dụng gạc họng, gạc mũi họng, dịch rửa phế quản phế nang, đờm. Kết quả phát hiện của sản phẩm này chỉ mang tính chất tham khảo lâm sàng và không nên được sử dụng làm kết quả duy nhất bằng chứng cho chẩn đoán và điều trị lâm sàng. Nên phân tích toàn diện về tình trạng này kết hợp với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân và các xét nghiệm khác trong phòng thí nghiệm.
Nguyên tắc kiểm tra
Bộ sản phẩm này dựa trên công nghệ RT- PCR một bước.Trên thực tế, gen ORF1ab và N của virus Corona mới (2019-nCoV) đã được chọn làm vùng mục tiêu khuếch đại.Các mồi và đầu dò huỳnh quang cụ thể (đầu dò gen N được dán nhãn FAM và đầu dò ORF1ab được dán nhãn HEX) được thiết kế để phát hiện RNA của coronavirus loại mới 2019 trong các mẫu.Bộ sản phẩm còn bao gồm hệ thống phát hiện kiểm soát nội sinh (đầu dò gen kiểm soát nội bộ được dán nhãn CY5) để theo dõi quá trình lấy mẫu, khuếch đại RNA và PCR, từ đó làm giảm kết quả âm tính giả.
Các thành phần chính
| Các thành phần | Âm lượng（48T/Bộ) |
| Dung dịch phản ứng RT-PCR | 96µl |
| Hỗn hợp thăm dò TaqMan mồi nCOV（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
| Kiểm soát tiêu cực | 1500µl |
| Kiểm soát dương tính nCOV(l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Thuốc thử riêng: Thuốc thử chiết hoặc tinh chế RNA.Kiểm soát âm tính/dương tính: Đối chứng dương tính là RNA chứa đoạn mục tiêu, trong khi đối chứng âm tính là nước không có axit nucleic.Trong quá trình sử dụng, chúng nên tham gia vào quá trình chiết xuất và được coi là có khả năng lây nhiễm.Chúng phải được xử lý và tiêu hủy theo các quy định có liên quan.
Gen tham chiếu bên trong là gen RnaseP của con người.
Điều kiện bảo quản và ngày hết hạn
-20±5oC, tránh đóng băng và rã đông nhiều lần hơn 5 lần, có giá trị trong 6 tháng.
Dụng cụ áp dụng
Với FAM / HEX / CY5 và thiết bị PCR huỳnh quang đa kênh khác.
Yêu cầu mẫu vật
1. Các loại mẫu bệnh phẩm có thể áp dụng: gạc họng, gạc mũi họng, dịch rửa phế quản phế nang, đờm。
2. Thu thập mẫu vật (kỹ thuật vô trùng)
Gạc họng: Lau amidan và thành sau họng bằng hai miếng gạc cùng lúc, sau đó nhúng đầu tăm bông vào ống nghiệm chứa dung dịch lấy mẫu
Đờm: Sau khi người bệnh ho sâu, lấy đờm ho ra vào ống nghiệm có nắp vặn chứa dung dịch lấy mẫu;dịch rửa phế quản phế nang: Lấy mẫu bởi các chuyên gia y tế.3. Bảo quản và vận chuyển mẫu
Các mẫu phân lập virus và xét nghiệm RNA nên được xét nghiệm càng sớm càng tốt.Mẫu vật có thể được phát hiện trong vòng 24 giờ có thể được bảo quản ở 4oC;những thứ không thể được phát hiện trong vòng 24
giờ nên được bảo quản ở -70oC hoặc thấp hơn (nếu không có điều kiện bảo quản ở -70oC thì chúng phải được bảo quản
được bảo quản tạm thời ở tủ lạnh -20oC).Các mẫu nên tránh đóng băng và rã đông nhiều lần trong quá trình vận chuyển.Mẫu bệnh phẩm phải được gửi đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt sau khi thu thập.Nếu mẫu cần được vận chuyển đi xa thì nên bảo quản bằng đá khô.
Phương pháp thử
1 Xử lý mẫu và tách chiết RNA (khu vực xử lý mẫu)
Nên lấy 200μl mẫu lỏng để chiết RNA.Để biết các bước chiết liên quan, hãy tham khảo hướng dẫn của bộ chiết RNA thương mại.Cả tiêu cực và tiêu cực
các điều khiển trong bộ công cụ này có liên quan đến quá trình trích xuất.
2 Chuẩn bị thuốc thử PCR (khu vực chuẩn bị thuốc thử)
2.1 Lấy tất cả các thành phần ra khỏi bộ sản phẩm, rã đông và trộn ở nhiệt độ phòng.Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong vài giây trước khi sử dụng;tính toán lượng thuốc thử cần thiết và hệ thống phản ứng được chuẩn bị như trong bảng sau:
| Các thành phần | Khẩu phần N (hệ thống 25µl) |
| Hỗn hợp đầu dò TaqMan mồi nCOV | 18 µl × N |
| Dung dịch phản ứng RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = số lượng mẫu được xét nghiệm + 1 (đối chứng âm tính) + 1 (nCOVkiểm soát tích cực) | |
2.2 Sau khi trộn kỹ các thành phần, ly tâm trong thời gian ngắn để toàn bộ chất lỏng trên thành ống rơi xuống đáy ống, sau đó chia hệ thống khuếch đại 20 µl vào ống PCR.
3 Lấy mẫu (khu vực chuẩn bị mẫu)
Thêm 5μl chất đối chứng âm và dương sau khi chiết.RNA của mẫu cần kiểm tra được thêm vào ống phản ứng PCR.
Đậy nắp ống thật chặt và ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong vài giây trước khi chuyển ống đến vùng phát hiện khuếch đại.
4 Khuếch đại PCR (khu vực phát hiện khuếch đại)
4.1 Đặt ống phản ứng vào khoang chứa mẫu của thiết bị và cài đặt các thông số như sau:
| sân khấu | Xe đạp con số | Nhiệt độ(°C) | Thời gian | bộ sưu tậpđịa điểm |
| Đảo ngượcphiên mã | 1 | 42 | 10 phút | - |
| Tiền biến tínhn | 1 | 95 | 1 phút | - |
| Xe đạp | 45 | 95 | 15 giây | - |
| 60 | 30 tuổi | thu thập dữ liệu |
Lựa chọn kênh phát hiện thiết bị: Chọn kênh FAM、HEX、CY5 cho tín hiệu huỳnh quang.Để tham khảo huỳnh quang KHÔNG, vui lòng không chọn ROX.
5 Phân tích kết quả (Vui lòng tham khảo hướng dẫn thử nghiệm của từng thiết bị để cài đặt)
Sau phản ứng, lưu kết quả.Sau khi phân tích, điều chỉnh giá trị bắt đầu, giá trị kết thúc và giá trị ngưỡng của đường cơ sở theo hình ảnh (người dùng có thể điều chỉnh theo tình hình thực tế, giá trị bắt đầu có thể được đặt thành 3 ~ 15, giá trị kết thúc có thể được đặt thành 5~20, điều chỉnh) trong biểu đồ logarit Ở ngưỡng của cửa sổ, đường ngưỡng nằm trong pha logarit và đường cong khuếch đại của điều khiển âm là đường thẳng hoặc bên dưới đường ngưỡng).
6 Kiểm soát chất lượng (Kiểm soát thủ tục được bao gồm trong thử nghiệm) Kiểm soát tiêu cực: Không có đường cong khuếch đại rõ ràng cho các kênh phát hiện FAM, HEX, CY5
Kiểm soát dương tính COV: đường cong khuếch đại rõ ràng của kênh phát hiện FAM và HEX, giá trị Ct<32, nhưng không có đường cong khuếch đại của kênh CY5;
Các yêu cầu trên phải được đáp ứng đồng thời trong cùng một thí nghiệm;nếu không, thử nghiệm sẽ không hợp lệ và cần được lặp lại.
7 Xác định kết quả.
7.1 Nếu không có đường cong khuếch đại hoặc giá trị Ct > 40 ở kênh FAM và HEX của mẫu xét nghiệm và có đường cong khuếch đại ở kênh CY5 thì có thể phán đoán rằng không có vi rút Corona mới 2019 (2019-nCoV) RNA trong mẫu;
.2 Nếu mẫu xét nghiệm có đường cong khuếch đại rõ ràng trong các kênh FAM và HEX, đồng thời giá trị Ct là ≤40, thì có thể đánh giá rằng mẫu đó dương tính với vi rút Corona mới 2019 (2019-nCoV).
7.3 Nếu mẫu thử nghiệm chỉ có đường cong khuếch đại rõ ràng ở một kênh FAM hoặc HEX và giá trị Ct là 40 và không có đường cong khuếch đại ở kênh kia thì cần phải kiểm tra lại kết quả.Nếu kết quả xét nghiệm lại phù hợp thì mẫu có thể được đánh giá là dương tính với mẫu mới.
vi-rút Corona 2019 (2019-nCoV).Nếu kết quả xét nghiệm lại là âm tính thì có thể đánh giá rằng mẫu đó âm tính với vi rút Corona mới 2019 (2019-nCoV).
Giá trị phán đoán tích cực
Phương pháp đường cong ROC được sử dụng để xác định giá trị CT tham chiếu của bộ sản phẩm và giá trị tham chiếu kiểm soát nội bộ là 40.
Giải thích kết quả kiểm tra
1.Mỗi thí nghiệm phải được kiểm tra để tìm đối chứng âm tính và dương tính.Kết quả thử nghiệm chỉ có thể được xác định khi các biện pháp kiểm soát đáp ứng các yêu cầu kiểm soát chất lượng
2.Khi các kênh phát hiện FAM và HEX dương, kết quả từ kênh CY5 (kênh điều khiển nội bộ) có thể âm do cạnh tranh hệ thống.
3.Khi kết quả kiểm soát nội bộ là âm tính, nếu các kênh phát hiện FAM và HEX của ống nghiệm cũng âm tính, điều đó có nghĩa là hệ thống bị vô hiệu hóa hoặc hoạt động sai, xét nghiệm không hợp lệ.Vì vậy, mẫu cần phải được kiểm tra lại.
