Các sản phẩm
Bộ dụng cụ phát hiện Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR cho 2019-nCoV
Dự kiến sử dụng
Bộ dụng cụ này được sử dụng để phát hiện định tính vi-rút corona mới (2019-nCoV) bằng cách sử dụng tăm bông họng, tăm bông mũi họng, dịch rửa phế quản phế nang, đờm. Kết quả phát hiện của sản phẩm này chỉ mang tính chất tham khảo lâm sàng và không nên được sử dụng làm bằng chứng duy nhất cho chẩn đoán và điều trị lâm sàng. Nên phân tích toàn diện tình trạng bệnh kết hợp với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân và các xét nghiệm khác.
Nguyên tắc kiểm tra
Bộ dụng cụ này dựa trên công nghệ RT-PCR một bước. Trên thực tế, gen ORF1ab và N của virus corona mới 2019 (2019-nCoV) đã được chọn làm vùng mục tiêu khuếch đại. Các đoạn mồi và đầu dò huỳnh quang đặc hiệu (đầu dò gen N được gắn nhãn FAM và đầu dò ORF1ab được gắn nhãn HEX) được thiết kế để phát hiện RNA của virus corona chủng mới 2019 trong các mẫu. Bộ dụng cụ này cũng bao gồm một hệ thống phát hiện kiểm soát nội bộ nội sinh (đầu dò gen kiểm soát nội bộ được gắn nhãn CY5) để theo dõi quá trình thu thập mẫu, khuếch đại RNA và PCR, do đó làm giảm kết quả âm tính giả.
Thành phần chính
| Thành phần | Âm lượng（48T/Bộ) |
| Dung dịch phản ứng RT-PCR | 96µl |
| Hỗn hợp thăm dò TaqMan mồi nCOV（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
| Kiểm soát tiêu cực | 1500µl |
| Kiểm soát dương tính nCOV(l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Thuốc thử riêng: Thuốc thử chiết xuất hoặc tinh chế RNA. Kiểm soát âm tính/dương tính: Kiểm soát dương tính là RNA chứa đoạn mục tiêu, trong khi kiểm soát âm tính là nước không có axit nucleic. Trong quá trình sử dụng, chúng phải tham gia vào quá trình chiết xuất và phải được coi là có khả năng lây nhiễm. Chúng phải được xử lý và thải bỏ theo các quy định có liên quan.
Gen tham chiếu nội bộ là gen RnaseP của con người.
Điều kiện bảo quản và ngày hết hạn
-20±5℃, tránh đông lạnh và rã đông nhiều lần quá 5 lần, thời hạn sử dụng 6 tháng.
Công cụ áp dụng
Với FAM / HEX / CY5 và các thiết bị PCR huỳnh quang đa kênh khác.
Yêu cầu mẫu vật
1. Các loại mẫu áp dụng: tăm bông họng, tăm bông mũi họng, dịch rửa phế quản phế nang, đờm.
2. Thu thập mẫu (kỹ thuật vô trùng)
Tăm bông hầu họng: Lau sạch amidan và thành sau hầu họng bằng hai miếng tăm bông cùng lúc, sau đó nhúng đầu tăm bông vào ống nghiệm chứa dung dịch lấy mẫu.
Đờm: Sau khi bệnh nhân ho mạnh, thu thập đờm ho vào ống nghiệm có nắp vặn chứa dung dịch lấy mẫu; dịch rửa phế nang phế quản: Lấy mẫu bởi các chuyên gia y tế. 3. Lưu trữ và vận chuyển mẫu
Mẫu xét nghiệm phân lập virus và xét nghiệm RNA cần được xét nghiệm càng sớm càng tốt. Mẫu có thể phát hiện trong vòng 24 giờ có thể bảo quản ở nhiệt độ 4℃; mẫu không thể phát hiện trong vòng 24 giờ
giờ nên được lưu trữ ở nhiệt độ -70℃hoặc thấp hơn (nếu không có điều kiện lưu trữ ở nhiệt độ -70℃, chúng nên được
tạm thời được lưu trữ ở tủ lạnh -20℃). Các mẫu vật nên tránh đông lạnh và rã đông nhiều lần trong quá trình vận chuyển. Các mẫu vật nên được gửi đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt sau khi thu thập. Nếu cần vận chuyển mẫu vật trên quãng đường dài, nên bảo quản bằng đá khô.
Phương pháp thử nghiệm
1 Xử lý mẫu và chiết xuất RNA (khu vực xử lý mẫu)
Nên lấy 200μl mẫu lỏng để chiết xuất RNA. Để biết các bước chiết xuất liên quan, hãy tham khảo hướng dẫn của bộ dụng cụ chiết xuất RNA thương mại. Cả âm tính và âm tính
các biện pháp kiểm soát trong bộ dụng cụ này đã tham gia vào quá trình chiết xuất.
2 Chuẩn bị thuốc thử PCR (khu vực chuẩn bị thuốc thử)
2.1 Lấy tất cả các thành phần ra khỏi bộ dụng cụ và rã đông rồi trộn ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong vài giây trước khi sử dụng; tính toán lượng thuốc thử cần thiết và hệ thống phản ứng được chuẩn bị như trong bảng sau:
| Thành phần | N phục vụ (hệ thống 25µl) |
| Hỗn hợp đầu dò TaqMan mồi nCOV | 18 µl × N |
| Dung dịch phản ứng RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = số mẫu được xét nghiệm + 1 (kiểm soát âm tính) + 1 (nCOVkiểm soát tích cực) | |
2.2 Sau khi trộn đều các thành phần, ly tâm trong thời gian ngắn để toàn bộ chất lỏng trên thành ống rơi xuống đáy ống, sau đó chia nhỏ 20 µl hệ thống khuếch đại vào ống PCR.
3 Lấy mẫu (khu vực chuẩn bị mẫu)
Thêm 5μl mẫu đối chứng âm tính và dương tính sau khi chiết xuất. RNA của mẫu cần thử nghiệm được thêm vào ống phản ứng PCR.
Đậy chặt nắp ống và ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong vài giây trước khi chuyển ống đến khu vực phát hiện khuếch đại.
4 khuếch đại PCR (khu vực phát hiện khuếch đại)
4.1 Đặt ống phản ứng vào ô mẫu của thiết bị và cài đặt các thông số như sau:
| sân khấu | Xe đạp con số | Nhiệt độ(°C) | Thời gian | bộ sưu tậpđịa điểm |
| Đảo ngượcphiên âm | 1 | 42 | 10 phút | - |
| Tiền biến tínhn | 1 | 95 | 1 phút | - |
| Xe đạp | 45 | 95 | 15 giây | - |
| 60 | 30 tuổi | thu thập dữ liệu |
Lựa chọn kênh phát hiện thiết bị: Chọn kênh FAM、HEX、CY5 cho tín hiệu huỳnh quang. Đối với huỳnh quang tham chiếu NONE, vui lòng không chọn ROX.
5 Phân tích kết quả (Vui lòng tham khảo hướng dẫn thử nghiệm của từng thiết bị để cài đặt)
Sau phản ứng, lưu kết quả. Sau khi phân tích, điều chỉnh giá trị bắt đầu, giá trị kết thúc và giá trị ngưỡng của đường cơ sở theo hình ảnh (người dùng có thể điều chỉnh theo tình hình thực tế, giá trị bắt đầu có thể được đặt thành 3 ~ 15, giá trị kết thúc có thể được đặt thành 5 ~ 20, điều chỉnh) trong đồ thị logarit Tại ngưỡng của cửa sổ, đường ngưỡng nằm trong pha logarit và đường cong khuếch đại của đối chứng âm là đường thẳng hoặc bên dưới đường ngưỡng).
6 Kiểm soát chất lượng (Kiểm soát thủ tục được bao gồm trong thử nghiệm) Kiểm soát âm tính: Không có đường cong khuếch đại rõ ràng cho các kênh phát hiện FAM, HEX, CY5
Kiểm soát dương tính với COV: đường cong khuếch đại rõ ràng của kênh phát hiện FAM và HEX, giá trị Ct ≤32, nhưng không có đường cong khuếch đại của kênh CY5;
Các yêu cầu trên phải được đáp ứng đồng thời trong cùng một thí nghiệm; nếu không, thí nghiệm sẽ không hợp lệ và cần phải lặp lại.
7 Xác định kết quả.
7.1 Nếu không có đường cong khuếch đại hoặc giá trị Ct > 40 ở kênh FAM và HEX của mẫu thử nghiệm, đồng thời có đường cong khuếch đại ở kênh CY5 thì có thể phán đoán không có RNA của virus corona mới 2019 (2019-nCoV) trong mẫu;
.2 Nếu mẫu thử có đường cong khuếch đại rõ ràng ở các kênh FAM và HEX và giá trị Ct ≤40 thì có thể phán đoán mẫu dương tính với vi-rút corona mới năm 2019 (2019-nCoV).
7.3 Nếu mẫu thử có đường cong khuếch đại rõ ràng chỉ trong một kênh FAM hoặc HEX, và giá trị Ct ≤40, và không có đường cong khuếch đại trong kênh kia, kết quả cần được kiểm tra lại. Nếu kết quả kiểm tra lại nhất quán, mẫu có thể được đánh giá là dương tính với mẫu mới
virus corona 2019 (2019-nCoV). Nếu kết quả xét nghiệm lại là âm tính, có thể đánh giá mẫu xét nghiệm âm tính với virus corona mới 2019 (2019-nCoV).
Giá trị phán đoán tích cực
Phương pháp đường cong ROC được sử dụng để xác định giá trị CT tham chiếu của bộ dụng cụ và giá trị tham chiếu kiểm soát nội bộ là 40.
Giải thích kết quả thử nghiệm
1. Mỗi thí nghiệm phải được kiểm tra đối chứng âm tính và dương tính. Kết quả thử nghiệm chỉ có thể được xác định khi đối chứng đáp ứng các yêu cầu kiểm soát chất lượng
2. Khi các kênh phát hiện FAM và HEX dương, kết quả từ kênh CY5 (kênh kiểm soát nội bộ) có thể âm do sự cạnh tranh của hệ thống.
3. Khi kết quả kiểm soát nội bộ là âm tính, nếu kênh phát hiện FAM và HEX của ống nghiệm cũng âm tính, thì có nghĩa là hệ thống bị vô hiệu hóa hoặc thao tác sai, xét nghiệm không hợp lệ. Do đó, cần phải xét nghiệm lại mẫu.
